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学术文章

王钢论文《辽宁中医杂志》肾炎灵颗粒剂治疗慢

来源:南京博大 时间:2014-10-30 20:15 点击: 次

文献出处:《辽宁中医杂志》  2001年11月  第28卷 第11期

肾炎灵颗粒剂治疗慢性原发性肾小球疾病研究(2)

-----病理细胞学研究部

王 钢, 孙 伟, 邵家德, 曾安平, 孔 薇, 周恩超, 邹燕勤

( 江苏省中医院全国中医肾病医疗中心, 江苏南京210029)

关键词: 肾炎灵颗粒剂; 慢性原发性肾小球疾病; 嘌呤霉素; 系膜细胞; 成纤维细胞

中图分类号: R2561 5691 26   文献标识码: B    文章编号: 1000- 1719( 2001) 11- 0643- 03

病  理

1  材料与方法

1.1 材料    健康成年Wistar 雄性大白鼠16 只, 体重为( 185±13) g, 由中科院上海实验动物中心提供。造模药物为1%的嘌呤霉素, 购自Sigma 化学公司。治疗药物肾炎灵颗粒剂由本院制剂室配制, 批号: 960715。

1.2 方法    造模方法: 大鼠购回后静养3 日, 随机分为病理组和治疗组各8 只。肾病模型制作方法参考Vernier RL 的报道, 给实验大鼠腹腔注射嘌呤霉素10mg/ kg·d- 1, 从第1次注射日算起, 连续1 周。

    治疗方法: 治疗组大鼠除常规注射嘌呤霉素外, 从第1次注射嘌呤霉素起, 按成人每日每公斤体重的10 倍量, 经胃灌服肾炎灵颗粒剂, 每日2 次, 持续3 周。病理组大鼠每日喂服相同量的自来水, 其它同治疗组。

    观察指标: 实验大鼠分别每周用代谢笼收集24h 尿量,检测尿蛋白定量, 并在实验第3 周眼眶采血, 分别检测血浆总胆固醇、甘油三酯及血清白蛋白含量, 并取肾脏组织进行光镜检查。

2  结  果

2.1    24h尿蛋白定量的变化   所有大鼠于注射后第2 周、第3 周留取24h 尿液, 检测尿蛋白定量。结果显示, 病理组尿蛋白定量明显高于治疗组尿蛋白定量, 见表11。

表11  实验大鼠24h 尿蛋白定量的变化( X ± S )

 

第2周

第3周

病理组

2.17±0.48

2.01±0.38

治疗组

0.84±0.40

0.65±0.25

P

<0.001

<0.001

2.2 血浆总胆固醇甘油三酯及血清白蛋白含量的变化

    所有大鼠于实验第3 周血液生化检测结果显示, 病理组总胆固醇及甘油三酯高于治疗组, 血清白蛋白含量低于治疗组,见表12。

表12   实验大鼠血液生化变化( X ± S )

 

病理组

治疗组

P

血清白蛋白

3.2±0.26

3.54±0.28

<0.05

TC

95.98±14.25

74.84±7.38

<0.01

TG

61.20±7.51

46.81±5.79

<0.001

2.3 肾脏组织检查 HE 染色光镜肾脏病理检查结果为正常组: 肾小球体积在正常范围内, 细胞数60~80 个/球, 为肾之固有细胞系膜基质正常, 袢开放好, 基膜不厚, 包囊壁无明确病变, 小管间质基本正常。病理组: 肾小球体积增大, 细胞数> 100个/球, 脏层上皮细胞肿胀、增生, 袢腔内成对或3个内皮细胞, 系膜基质轴性增生, 袢开放尚好, 壁层上皮增生, 血管内皮细胞肿胀、增生, 少数炎细胞浸润, 小管周围毛细血管增宽, 小管腔内大量蛋白管型, 小管间质无明确病变。治疗组: 肾小球体积略大, 细胞数80个/球, 偶见内皮细胞成对, 节段系膜区见2~3个系膜细胞, 脏层上皮轻度肿胀, 袢开发好, 小管间质无明确病变。

细 胞 学

1 材料与方法

1.1 材料    肾系膜细胞和成纤维细胞的培养: 取200~250g Wistar 雄性大鼠肾脏, 用Siv eing 法分离纯化肾小球后,将肾小球用含20% 小牛血清的Dulbeccocs modified Eag lecsmedia( DM EM) ( Commonw ealt h Serum Laboratory , Austr alia)初代培养, 待细胞融汇后消化传代。实验用第9 代的肾系膜细胞。Wistar 大鼠成纤维细胞, 由日本国东京老年病研究中心提供, 实验用第6 代的肾成纤维细胞。肾炎灵颗粒剂实验用血清的制备: 200g Wistar 大鼠9只, 每日插胃管喂药1 次, 肾炎灵颗粒剂药量为成人每日药量的10 倍(2.4g) , 持续1 周, 无菌采集血清后冷冻保存备用。

1.2 方法    将大鼠系膜细胞/ 成纤维细胞接种于96 孔培养板上( 1×104/ w ell) , 于37℃, 5%CO2 培养箱内培养。培养液用10%FCS/ DMEM。在系膜细胞/ 成纤维细胞完全贴壁后,变换无血清培养液0.2%FCS/ DMEM 培养24h。然后弃培养液。治疗组加入含有0.5%、2%、5%、10%、20%喂服肾炎灵颗粒剂的大鼠血清。对照组用未喂药大鼠血清培养液,研究的每种药物浓度设4 个复孔, 继续孵育24h, 加入3Hthymidine37KBg(1µci)/well( Amersham ) 刺激4h, 吸弃每个孔中的液体, 用置于冰上的PBS 冲洗, 加入10%Trichloroacetic acid solution (TCA) , 放置冰上30min, 吸弃TCA, 加入新的10%TCA5min, 再用冰上的PBS 冲洗2 次,加入100µl/well 的0.5M NaOH, 置室温中14h 以上, 加入10µl 5M HCl, 然后吸取每孔中的液体分别注入装有3ml 闪烁液的闪烁杯中, 用液体闪烁计数仪测量放射性, 每个标本5min, 并记录标本CPM 值进行统计。

2   结  果

2.1 肾炎灵颗粒剂对肾系膜细胞增殖的影响 如图1 所示, 喂服肾炎灵颗粒剂大鼠的血清对系膜细胞的3H- t hym-idine 掺入率有明显的抑制作用。而且在01 5%的低浓度时即显示有明显的抑制作用(11463166 ± 10193135) CPM, 与0.5%未喂药大鼠血清培养液对照组的掺入率( 34268135 ±13131118) CPM 对比, 有显著性差异( P< 0.05~0.01) , 见表13、图1。

表13  肾炎灵颗粒剂对大鼠

MC 3H-thymidine 掺入率的影响( CPM, X ± S )

浓度(%)

治疗组(n=4)

对照组(n=4)

t

P

0.5

11463.66±10193.35

34268.35±13131.18

2.744

<0.05

2.0

2604.29±446.267

46447.82±3166.222

27.423

<0.01

5.0

29878.07±18734.26

50038.53±27814.63

2.41

<0.05

10.0

7007.24±5500.822

53822.52±8471.342

9.27

<0.01

20.0

2682.315±3335.971

37718.07±25691.4

2.705

<0.05

2.2 肾炎灵颗粒剂对肾成纤维细胞增殖的影响 如图2 所示, 喂服肾炎灵颗粒剂大鼠的血清对成纤维细胞的3Hthymidine 掺入率在0.5%、2.0% 、5.0% 浓度时与对照组相比, 无明显抑制作用( P > 0.05) , 在10%、2 0% 浓度时, 治疗组3H- thymidine 的掺入率出现了有意义的下降( 10% 浓度80936108 ± 327211 93 CPM, 20% 浓度33725109 ±

13112117CPM) , 与对照组的掺入率( 10% 浓度131402129 ±

12137189CPM, 20%浓度127271130 ± 379671 61 CPM) 对比,有非常显著性差异(P< 0.01) , 见表14、图2。

表14 肾炎灵颗粒剂对大鼠成

纤维细胞3H-thymidine 掺入率的影响( CPM, X ± S )

浓度(%)

治疗组(n=4)

对照组(n=4)

t

P

0.5

16456.42±4255.93

51206.53±5153.19

1.391

<0.05

2.0

49684.89±31756.73

41437.07±25463.11

0.404

<0.05

5.0

65547.40±17377.03

92182.16±13873.76

2.396

<0.05

10.0

80936.08±32721.93

131402.29±12137.89

2.839

<0.05

20.0

33725.09±13112.17

127271.30±37967.61

4.658

<0.01

3   讨  论

3.1 慢性肾炎发生的关键在于脏腑虚损    其中又以脾肾虚损为主, 我院邹云翔教授认为, 本病“是内因与外因两方面的因素所决定的。内因主要是指人体的肾气, 外因就是外感六淫之邪以及疮毒之类。肾气不足, 病邪乘虚而入, 导致肾炎的发生。反之, 肾气充足的人, 纵遇六淫或疮毒之类侵袭, 也不致受其所害而发肾炎。” [ 3] 《诸病源候论·水病诸候》指出:“水病无不由脾肾虚所为, 脾肾虚则水妄行, 盈溢皮肤而令周身肿满” 。《丹溪心法》也说: “夫人之所以得全其性命者, 水与谷而已, 水则肾主之, 谷则脾主之, 惟肾虚不能行水, 惟脾虚不能制之, 肾与脾合气, 胃为水谷之海, 又因虚不能传化焉, 故肾水泛滥反得以浸渍脾土, 于是三焦停滞, 经络壅塞,水渗于皮肤, 注于肌肉而发水肿矣。” 盖肾为先天之本, 主水之气化, 精液之贮藏, 其府为腰, 为一身阴阳之根本, 可温润脾土, 涵养肝水。因此, 肾虚则封藏失职, 精微随尿外溢则为蛋白尿, 肾气亏虚腰失所养可见腰痛, 诚如《素问·脉要精微论篇》所说: “ 腰者, 肾之府, 转摇不能, 肾将惫矣。” 肝肾阴虚,水不涵本, 肝阳上亢则又可发生眩晕。脾为后天之本, 气血生化之源, 主运化水谷, 化生气血精微, 充养肌肉四肢, 且养先天, 故脾失健运则水湿停聚而发水肿;水湿停聚日久郁而化热, 湿热下注, 损伤肾络, 或素体肾阴不足, 虚火灼伤肾络,则见尿血; 病久肾之精微外泄, 脾虚又不能化生精微, 以充养气血则出现气血虚弱或致气阴不足诸证。肺主气以卫外, 主宣发肃降以通调水道, 若肺气虚弱, 卫外不固, 则易感外邪而使水道不通, 又可加重面部及全身浮肿。因此, 慢性肾炎急性发作之时, 与肺脏也有一定的关系。由此可见, 慢性肾炎水肿之发生与肺脾肾密切相关, 尤以肾为主。三脏在生理上互相联系, 在病理上又可互相影响, 从而导致慢性肾炎发生、发展。正如《景岳全书》所言: “凡水肿等证, 乃肺脾肾三脏相干之病, 盖水为至阴, 故其本在肾, 水化于气, 故其标在肺, 水惟畏土, 故其制在脾”。

3.2 湿热瘀血是慢性肾炎常见的病理因素     慢性肾炎虽以脾肾亏虚为本, 然而往往因虚致实。实邪在慢性肾炎的各种类型、各个阶段都是存在的, 并且对于正虚的程度、疾病的过程都有极大的影响, 不能不高度重视。常见的实邪有外邪、热毒、湿热、瘀血、浊邪等, 但又以湿热、瘀血为最重要的病理因素。

    中医湿热理论在现代医学肾脏病的治疗上有重要的指导意义, 湿热伤肾是肾病的基本特点, 且往往贯穿病程的始终[4] 。故有人认为, 无论是肾脏病的水肿, 蛋白尿、血尿、高胆固醇、氮质滞留、尿素积聚都与湿热有直接或间接的关系[5] 。如上所述, 慢性肾炎以脾肾虚损为其发病内因, 水液代谢紊乱是其基本的病理变化, 而水湿内停则有寒化、热化两途。在临床上湿邪热化, 进而酿成湿热, 其出现率是相当高的, 其原因可能与下列几点有关: ①湿邪郁久化热; ②热毒侵袭与湿相搏; ③ 利水伤阴, 滋生内热; ④过服温阳之药或激素类药。湿热既是脏腑功能失调的病理产物, 又可成为新的致病因素, 如损伤正气, 可使阴阳气血消耗, 与湿毒兼夹为患, 使病情反复难愈; 阻滞脉络, 气血运行不畅而为瘀血; 还可导致外感, 内外相合, 加重病情。可以说它是疾病发生、发展颇为重要的因素之一。因此, 在慢性肾炎的治疗过程中,如何阻断湿热这一环节, 对于正气的恢复、病情的改善都是极有裨益的。

    瘀血内阻也是慢性肾炎不能忽视的另一病理因素。现代医学研究表明, 血液高粘滞状态和凝血机制紊乱对原发性肾小球疾病的发生、发展具有重要的影响, 在临床上则表现为血液流变学的改变, 与祖国医学的瘀血病机相吻合。慢性肾炎瘀血证的形成大致与以下几点因素有关: ① 因虚致瘀;② 水停致瘀;  ③病邪致瘀; ④激素致瘀; ⑤久病入络致瘀。瘀血虽然也是脏腑功能失调的病理产物, 但亦可成为新的致病因素。近几年来研究发现, 肾小球毛细血管内凝血和纤溶障碍是肾小球肾炎不可逆病变形成的决定性因素之一, 而且还可导致肾脏组织损伤和肾功能减退[6] 。因此, 在临床上重视活血化瘀法的应用, 改善患者的高粘、高凝状态, 这对于阻断肾脏的病理损害, 促使肾小球损伤修复, 进一步改善肾功能,延缓病情的进展, 都将具有十分重要的意义。

3.3 肾炎灵颗粒剂的组方依据及功效     既往治疗本病总以辨证施治水煎剂为主, 但取效慢, 疗程长, 煎煮麻烦, 不能适应临床需要。笔者过去有运用肾炎合剂、肾炎合剂II号治疗慢性肾炎的成功经验[78] , 继后10 年中, 在临床进一步观察了雷公藤治疗慢性肾炎的毒副反应, 分析了雷公藤治疗无效病例的原因, 经反复修改组合成最佳配伍的肾炎灵颗粒剂,主要功效为益气养阴、解毒和络、清利湿热。本方既体现了辨证论治, 又突出了治疗的主要矛盾(热毒、瘀血、湿热) , 药物少, 疗效高, 副反应少。其中雷公藤、生黄芪是主药。药理研究发现, 雷公藤有抗炎、免疫抑制作用, 毒副反应主要是肝功能损害、白细胞减少、胃肠道反应等。加入大剂量甘温的黄芪后, 既起到调节免疫作用, 又制约了雷公藤的苦寒之味和毒副反应, 保护肝功能, 升高白细胞, 并发现大剂量黄芪和雷公藤合用还可提高降尿蛋白效果; 再配伍甘草、山萸肉, 一方面可增强雷公藤类激素样作用, 又经实验证明, 可防止肝损害。通过临床观察, 肾炎灵颗粒剂主要起到下列作用: ①既能有效地降低蛋白尿、红细胞尿, 又有改善肾功能作用, 适合于各种类型肾炎患者, 也可用于慢性肾衰氮质血症期有大量蛋白尿患者; ②显著提高了血浆白蛋白, 增强了抗病能力,有利于消除水肿, 恢复体力; ③明显改善高脂血症、高粘高凝血症, 廓清了人体内环境, 既有利于改善病情, 更能清除致病之因, 巩固疗效; ④帮助撤减激素, 副反应明显小于肾炎合剂II号及雷公藤多甙片。

3.4 肾炎灵颗粒剂临床疗效     单纯肾炎灵颗粒剂治疗的195 例并与肾炎四味片作对照, 近期总有效率肾炎灵颗粒剂为87.18%, 而肾炎四味片总有效率为57.14%, 治疗组明显高于对照组, 两组总有效率经X2 检验, P 值< 0.05, 见表3。结合西医的临床分型来看, 对隐匿型肾小球疾病及慢性肾炎的疗效较好, 而对肾病综合征疗效相对较差, 但总有效率也在74%以上, 见表4。按中医辨证分型, 以气阴两虚证、脾肾气虚证疗效较好, 肝肾阴虚证最差, 见表5。此外, 合用激素治疗的14 例难治性肾病综合征, 从近期疗效来看, 总有效率为85.7%, 其中对激素治疗无效9例, 有效7例; 对激素依赖的6 例全部有效, 4 例激素顺利撤减, 随访半年仅1例于停药1个月后复发。

    从肾炎灵颗粒剂的临床疗效来看, 可明显降低治疗组尿蛋白定量和尿红细胞计数, 对肾小管功能损伤有一定恢复作用, 减低肾功能不全患者的血BUN、Scr 含量, 见表8, 升高血浆白蛋白, 升高贫血患者RBC、Hb 的含量, 改善高脂血症、改善高粘血症, 显著减轻慢性肾炎患者的临床症状和体征(另文报道) , 从而对慢性肾炎起到良好的治疗效果。

所以, 肾炎灵颗粒剂适用于临床各类慢性原发性肾小球疾病,对该病的多种中医证型尤其是气阴两虚证、脾肾气虚证的疗效较好, 对于激素无效的顽固性病例合用激素能明显提高疗效, 并且可以对激素依赖病例顺利撤减激素, 且复发率低, 应用面较广, 疗效可靠,是治疗慢性原发性肾小球疾病的理想复方雷公藤制剂。

    肾炎灵颗粒剂作用机理。①本实验运用嘌呤霉素腹腔注射成功制作了大鼠肾病综合征动物模型, 出现高度蛋白尿, 低蛋白血症、高脂血症等生化学变化。多数学者认为, 是嘌呤霉素促进自由基产生而对肾小球损害所致[9~12] 。研究结果表明, 肾炎灵颗粒剂对实验性肾病大鼠的脂质代谢具有调整作用, 降低血浆胆固醇及甘油三酯的含量,从而减轻了高脂血症对肾脏的损害作用。电镜、光镜检查发现, 实验病理组内皮细胞及上皮细胞的肿胀、增生性损害, 明显大于治疗组, 显示肾炎灵颗粒剂可以减轻肾小球滤过膜的病理损害。同时见到, 病理组大鼠出现系膜基质轴性增生, 治疗组大鼠中未见系膜增生, 证明了肾炎灵颗粒剂治疗组的肾脏病理损害明显轻于病理组。另外, 在病理组的肾小管腔内见有大量蛋白管型, 而治疗组未见有此现象, 表明病理组大鼠具有大量蛋白尿的病理变化, 与尿液蛋白定量检查结果相符合。显示了肾炎灵可降低肾病大鼠的尿蛋白定量, 从而也可

减轻肾脏的继发性损害。 ②肾小球硬化和肾间质纤维化是引起终末期肾功能衰竭的主要原因及主要病理变化。因此,积极寻找防止肾小球硬化和肾间质纤维化的有效中药, 具有重要的意义。本研究在体外利用肾小球和肾间质的代表细胞, 观察了治疗肾小球疾病有效的中药肾炎灵颗粒剂对培养的肾系膜细胞和成纤维细胞增殖的抑制作用。结果表明, 喂服中药肾炎灵颗粒剂大鼠的血清, 对培养的系膜细胞(MC)3H- thymidine 的掺入率的抑制作用, 与小牛血清培养液对照组对比, 有非常显著性差异(P< 0.01) , 而且在0.5%低浓度时, 即显示有明显的抑制作用。喂服肾炎灵颗粒剂大鼠的血清对成纤维细胞的3H- thymidine 掺入率的抑制作用, 在10%、2 0%浓度时, 与10%、20% 未喂药大鼠血清培养液对照组相比, 有非常显著性差异(P< 0.01) 。提示肾炎灵颗粒剂治疗肾小球疾病的有效作用机理, 与其对肾系膜细胞和成纤维细胞增殖有明显抑制作用有关。推测其对增殖的抑制作用可能通过调控系膜细胞和成纤维细胞产生的共性增殖因子和细胞外基质成分有关。

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